Ⅰ.土壤农杆菌能将自身Ti质粒的T-DNA整合到植物染色体DNA上，诱发植物形成肿瘤。T-DNA中含有植物生长素合成酶基因（S）和细胞分裂素合成酶基因（R）,如图1所示，它们的表达与否能影响相应植物激素的含量，进而调节肿瘤组织的生长与分化。基因工程常用Ti质粒作为运载体，图2表示抗虫棉培育中使用的三种限制酶A、B、C的识别序列以及Ti质粒上限制酶切割位点的分布，抗虫基因内部不含切割位点，两侧标明序列为切割区域。
（1）据图2分析，切取抗虫基因时，使用限制酶 ，切割Ti质粒时，使用限制酶 。
（2）成功建构的重组质粒含有限制酶A的识别位点 个，若用酶C处理该重组质粒，将得到 个DNA片段。
（3）若抗虫基因插入的位置在R基因内部，筛选出 植株即是成功导入抗虫基因的棉花植株。
Ⅱ.单克隆抗体技术在生物工程中占有重要地位。请回答相关问题：
（4）科学家米尔斯坦和柯勒提出单克隆抗体制备技术的实验方案：把一种 细胞与能在体外大量增殖的 细胞进行诱导融合，使融合细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。
（5）在技术操作中，需要将融合细胞用 培养基进行筛选，并进行克隆化培养和 检测，以得到足够数量的符合要求的 （填“单”、“双”、“多”）核杂交瘤细胞。
（6）若将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，可从 中提取出大量的单克隆抗体。
（7）研究人员应用 ，改造了鼠源性抗体分子的结构，降低了鼠源性抗体的人体反应。
如图是应用生物工程技术获得人们需要的生物新品种或新产品的一些方法。请据图回答下列问题：
（1）在培育转人生长激素基因牛过程中，获取目的基因常用的方法是_____________，①过程需要的工具酶有_____________和_____________，②过程常用的方法是_____________。
（2）转人生长激素基因牛可通过分泌的乳汁来生产人生长激素，在基因表达载体中，人生长激素基因的首端必须含有_____________。③过程培养到桑椹胚或囊胚阶段，可以采用_____________和胚胎移植技术，培育出多头相同的转基因犊牛。为了使胚胎移植能成功，需要对代孕母牛进行_____________处理，使之与供体的生理状况保持相同。
（3）prG能激发细胞不断分裂，通过基因工程导入该调控基因来制备单克隆抗体，Ⅱ最可能是_____________细胞，Ⅲ代表的细胞具有_____________的特点。
（4）在抗虫棉培育过程中，受体细胞如果采用愈伤组织细胞，与采用叶肉细胞相比较，其优点是_____________⑤过程采用的技术是_____________。若要检测转基因抗虫棉细胞的染色体上是否插入了目的基因，可采用_____________技术。
I.南瓜果实的黄色和白色是由一对遗传因子（G和g）控制的，一对亲本杂交图解如图，请回答下列问题：
（1）叶老师说：“黄果和白果属于一对相对性状“。他判断的依据是 。遗传因子G和遗传因子g的根本区别是 。
（2）F1中白果的F2中出现白果：黄果=3:1的条件是：
① ；
②含不同遗传因子的配子随机结合；
③每种受精卵都能发育成新个体，且存活率相同。
（3）南瓜的扁盘形、圆形、长圆形三种瓜形由两对遗传因子（A、a和B、b）控制，现有2棵南瓜植株M、N（一棵结圆形南瓜，一棵结长圆形南瓜），分别与纯合扁盘形南瓜植株杂交获得大量F1，全为扁盘形，然后进行如下实验。
甲：M的F1全部与长圆形个体相交，所得后代性状及比例是扁盘形：圆形：长圆形=3:4:1.
乙：N的F1全部自交，所得后代性状及比例是扁盘形：圆形：长圆形=9:6:1。
①M的基因型为 ，N的基因型为 。
②假定N的F1就是图中的F1中的白果（三对基因独立遗传），那么其自交后代中白果圆形南瓜所占的比例是 。
II.南瓜易种植，抗病、抗虫能力强，产量高。有人突发奇想，欲用南瓜生产人胰岛素。下图是用农杆菌转化法培育转基因南瓜的示意图，请回答下列问题：
（1）图中的目的基因是 ，利用PCR技术扩增目的基因时与单链互补的引物在 （酶）作用下进行延伸合成子链，扩增循环6次可产生 个目的基因。
（2）载体a是 ，在①过程中将目的基因插入到载体a的[b] 上，再通过②整合到南瓜细胞染色体的DNA上，得到转基因南瓜细胞。
（3）过程③采用的技术是 ，检测该转基因南瓜是否可以产生胰岛素的方法是 。
人的血清白蛋白在临床上需求量很大。将人的血清白蛋白基因转入奶牛细胞中，就可以利用牛的乳腺细胞生产血清白蛋白。大致过程如下：
(1)①过程采集的精子要进行________处理，该过程自然状态下是在________ (场所）中完成的；②过程得到的卵母细胞，一般要培养到________阶段才能进行体外受精。
(2)要使人的血清白蛋白基因只在转基因牛的乳腺细胞中选择性表达，则③过程中要在目的基因前接上________(调控组件）。一般情况下，将基因表达载体通过________技术导入牛的受精卵。
(3)⑤过程称作________技术。培养过程中不仅要加入氧气维持细胞呼吸，还要提供________以维持PH。
(4)当早期胚胎发育到__ ____阶段时，将胚胎移入受体（代孕）母牛子宫内，受体母牛还需用激素进行________处理。
(15分)下图表示“华恢1号”抗虫水稻主要培育流程，据图回答：
（1）限制性核酸内切酶的作用特点能够识别双链DNA分子 ，并使特定部位的两个核苷酸之间的 键断开。其作用结果是产生 末端或 末端。
(2)杀虫基因通过①～④，最终在宿主细胞内维持稳定和表达的过程叫做 。
(3)组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图(示部分基因及部分限制酶作用位点)，据图分析：
①人工改造质粒时，要使抗虫基因能成功表达，还应插入 。
②人工改造质粒时，用限制酶Ⅰ处理，其目的是：
第一，去除和破坏质粒上的 (基因)，保证T－DNA进入水稻细胞后不会促进细胞的分裂和生长；
第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于 。
第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等。
③若用限制酶Ⅱ分别切割经过②过程改造的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒。分别在含四环素或卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长情况是 。
科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（ampr为抗氨苄青霉素基因），其中①—④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞。请据图作答：
（1）在构建基因表达载体时，可用一种或者多种限制酶进行切割。该酶的特点 。为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶 对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割，然后用DNA连接酶将它们连接起来。
（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体Ⅰ中含有 作为标记基因。
（3）研究人员通常采用 法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。通常采用 ________技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质。
（4）利用组织培养技术将导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄组织细胞培育成植株。图中③、④依次表示组织培养过程中番茄组织细胞的 过程。
（共20分）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。
请根据以上图表回答下列问题。
（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 。通过PCR技术扩增目的基因前，需要根据这两个基因的一段已知核苷酸序列来合成 。
（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一引物对需采用较高的退火温度？__________。
（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？ 。
（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的细菌B通常为 。
（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列可知，采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切得到DNA片段是_________种。
（6）构建重组DNA分子所用的限制性内切酶和DNA连接酶分别作用于图中的 处，
（填“a”或“b”）
（7）若将目的基因成功导入马铃薯细胞后通常需用到 技术得到马铃薯植株。该技术的核心步骤是 与再分化。
（8）马铃薯块茎合成淀粉时需要酶A的催化，若要获得马铃薯块茎生物反应器，则在构建动物致病菌的抗原基因表达载体时，应选择 基因的启动子。
图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp Ⅰ、BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、Sma Ⅰ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：
（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 连接。
（2）若用限制酶Sma Ⅰ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是 末端，其产物长度为 。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma Ⅰ完全切割，产物中共有 种不同DNA片段。
（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加 的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是 。
α1-抗胰蛋白缺乏症是一种在北美较为常见的单基因遗传病，患者成年后会出现肺气肿及其他疾病，严重者甚至死亡。对于该致病患者常可采用注射人α1-抗胰蛋白酶来缓解症状。
图1表示获取人α1-抗胰蛋白酶基因的两种方法，请回答下列问题：
①a过程是在 酶的作用下完成的，该酶的作用特点是 。
②c过程称为 ，该过程需要的原料是 。
③要确定获得的基因是否是所需的目的基因，可以从分子水平上利用 技术检测该基因的碱基序列。
（2）利用转基因技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵，最终培育出能在乳腺细胞表达人α1-抗胰蛋白酶的转基因羊，从而更易获得这种酶，简要过程如图2。
①获得目的基因后，常利用 技术在体外将其大量扩增。
②载体上绿色荧光蛋白（GEP）基因的作用是便于 。基因表达载体d，除图中的标示部分外，还必须含有 。
③若要使转基因羊的后代均保持其特有的性状，理论上应选用 技术进行繁殖。
在矮牵牛的体内能合成一种能抗除草剂的物质即抗草胺磷，下图是利用矮牵牛来培养转基因大豆的过程。
(1)图中①应为________________。在构建①的过程中，要用到的对识别的序列具有特异性的酶是________________。
(2)在将①导入土壤农杆菌之前，往往要用______处理土壤农杆菌，使之成为____细胞，然后将它们在缓冲液中混合培养以完成转化过程。
(3)②中的部分农杆菌不能在含四环素培养基上生长，其原因是_______________________。
(4)A→B过程需要在恒温箱中_________培养，注意观察、记录_________的生长情况。
(5)人工种子是以图中_________(用字母和箭头表示)过程中形成的_________、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过____________包装得到的种子。
(10分)请回答下列有关基因工程的问题。
下表是基因工程中几种限制酶识别序列及其切割位点。图是转基因香蕉的培育过程，含目的基因的外源DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。
⑴从转基因香蕉培育图中反映了质粒作为运载体的特点是____ _______，基因工程中还可以用____________作为运载体。
⑵图中的质粒和目的基因构建重组质粒，不能使用SmaI酶切割，原因是_________________
⑶下图是用_________________(限制）酶进行切割得到的目的基因。可以防止含目的基因的外源DNA片段切割后自身环化。
⑷人体细胞内含有抑制癌症发生的某基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。该基因含有800对碱基对(bp)，用BamHⅠ切割得到的400bp，200bp，200bp,.用EcoRⅠ再次切割得到100bp,300bp,150bp，50bp,200bp.而患者体内获取的这段基因，用BamHⅠ切割得到的区段变为400bp，400bp ，用EcoRⅠ再次切割得到100bp,300bp,150bp，250bp.在正常人体内BamHⅠ和EcoRⅠ识别序列分别有________个和_____个，患者体内发生了_________。
⑸下列有关基因工程的叙述错误的是（ ）（多选）
| A．质粒上的目的基因必须整合到受体细胞的DNA上才能不被分解 |
| B．以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同 |
| C．没有与目的基因重组的质粒也可以进入受体细胞 |
| D．质粒上的抗生素抗性基因有利于质粒与外源基因连接 |
人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，且疫苗生产和抗体制备的流程之一如下图：
（1）过程①代表的过程是 ，过程⑦的实验技术名称是 。
（2）过程③构建出的表达载体必须要含有 、 、 和目的基因等结构。
（3）过程⑥发生的生理过程是 。
（4）生产药物时可用微生物做受体细胞，那么④应采用 处理，使受体细胞处于 ，从而将表达载体导入受体细胞；药物生产也可用乳腺生物反应器，那么④则应采用 的方法，从而将表达载体导入受体细胞。
（5）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的 作疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可以从疑似患者体内分离出病毒，与已知病毒进行 比较；或用图中的 进行特异性结合检测。
(16分)“今又生”(Gendicine)是世界上首个被批准上市的基因治疗药物，其本质是利用腺病毒和人p53基因拼装得到的重组病毒。人的P53蛋白可对高危癌前病变的DNA损伤进行修复；对DNA损伤无法修复的细胞，P53蛋白则诱导其进入冬眠状态或细胞凋亡。“今又生”的载体采用毒性极弱的腺病毒，其基因不能整合到宿主细胞基因组中，也不能复制，无遗传毒性；载体经基因工程改造后。只需对细胞实施一次感染就可达到治疗的目的。请回答下列问题：
（1）在“今又生”的生产中，为了获得更高的安全性能，科学家选择性地放弃了一般的载体都应该具有的__________结构。构建表达载体时利用M酶与N酶进行酶切，酶切序列如右图所示。则M酶与N酶切出的末端能在____________酶的作用下相互连接。
（2）P53功能蛋白是由4条肽链组装而成，每条肽链均由393个氨基酸缩合而成。若考虑到翻译过程起始密码子和终止密码子的存在，则控制每条肽链合成的DNA至少应该含有_________个核苷酸，在脱水缩合形成P53蛋白时，需要脱去________个水分子
（3）在正常人体中试举出一种不含p53基因的细胞：______________。
(4)已知P53蛋白微量高效，只需极微量就可以完成功能。p53基因位于常染色体上。已知右图中1号个体的一条染色体上的p53基因突变为无功能的假基因。2号无家族病史，4号为“易患癌症者”。据图推测5号个体为__________“易患癌症者”的概率为______________。
(5)右图中4号个体为了治病，接受了“今又生”的基因治疗。在她接受注射后两个月，从她血液中提取了相关蛋白做了电泳分析，以便和治疗前进行对比。
但是患者慌乱中把治疗前后的底片搞混淆了，两张底片分别如右图所示，请据图判断她的治疗__________ (“有”或“没有”)效果，治疗后的电泳图是_____________(“左”或“右”)图。
基因工程是在现代生物学、化学和工程学基础上建立和发展起来的，并有赖于微生物学理论和技术的发展运用，基因工程基本操作流程如图所示，请据图分析回答：
(1)图中A是__________；最常用的是________；在基因工程中，需要在___________________________________酶的作用下才能完成剪接过程。
(2)在上述基因工程的操作过程中，可以遵循碱基互补配对原则的步骤有____________。(用图解中序号表示)
(3)不同种生物之间的基因移植成功，从分子水平分析，进行基因工程的主要理论依据是_______________________，也说明了生物共用一套_________________。
(4)研究中发现，番茄体内的蛋白酶抑制剂对害虫的消化酶有抑制作用，导致害虫无法消化食物而被杀死，人们成功地将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米体内，玉米获得了与番茄相似的抗虫性状，玉米这种变异的来源是________________。
(5)科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，并用基因工程的方法将该基因导入金茶花叶片细胞的染色体DNA上，经培养长成的植株具备了抗病性，这说明_______________________________________________。如果把该基因导入叶绿体DNA中，将来产生的配子中________(选填“一定”或“不一定”)含有抗病基因。
如图为利用生物技术获得生物新品种的过程示意图。请回答下列问题：
（1）甲图所示为 技术，可以用来扩增目的基因。此过程中所使用的酶是 。
（2）乙图为获得抗虫棉技术的流程。A过程需要的酶有________、________。图中将目的基因导入植物受体细胞采用的方法是 。 在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因(kanr)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。则C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入___ _____。
（3）检测目的基因是否转录出mRNA的具体方法是使用标记的______与提取出的_____做分子杂交。
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