在荧光素酶中加入正确的荧光素底物就可以发荧光。荧光素酶及其合成基因在生物研究巾有着广泛的应用。请回答下列问题：
（1）荧光素酶基因可以人工合成，也可以从 中获取。利用PCR技术扩增荧光素酶基因是利用___ _的原理。
（2）限制酶是切割DNA的工具酶，主要从 中分离纯化出来。下表为4种限制酶的识别序列和酶切
位点，下图为含有荧光素酶基因的DNA片段及其具有的限制酶切点。若需利用酶切法（只用一种酶）获得荧光素酶基因，最应选择的限制酶是
（3）荧光素酶基因常被作为基因工程中的标记基因，其作用是将 筛选出来。荧光素酶基因也可以作为目的基因转入某些动植物细胞中表达产生荧光素酶。将目的基因导入动物细胞的技术中，应用最多的是____。
（4）将目的基因导入植物细胞，目前常用的目的基因载体是Ti质粒，目的基因需插入到该基因载体的 上。将导人荧光素酶基因的植物细胞，可经过 技术获得转基因植株。
I.某种鸟类（2N=76）为ZW性别决定，其羽毛中的黑色素由等位基因A、a中的A基因控制合成，且A基因越多，色素越多。回答下列问题：
（1）若等位基因A、a位于Z染色体上
①雌性鸟类羽毛的颜色有____________种，其基因型是________________________。
②用两只羽毛颜色相同的个体杂交，子代出现了性状分离现象，则亲代雌雄个体的基因型分别为____________，子代中黑色羽毛：灰色羽毛：白色羽毛=____________。
（2）若等位基因A、a位于常染色体上，另有一对不在性染色体上的控制色素分布的等位基因B、b。研究者进行了右图所示的杂交实验：
①根据杂交实验可以判断，这两对等位基因的遗传_________（填“是”或“否”）遵循基因的自由组合定律；灰色斑点的基因型是___________。
②F2中基因型种类最多的性状是__________，让F2中的纯灰色雄鸟与灰色斑点雌鸟杂交，子代新出现的羽毛性状占____________。
③斑点羽毛的鸟在自然环境中比纯色羽毛的鸟更容易被天敌发现，将F2全部个体放归自然界多年后，种群中a基因的频率将____________（“变大”或“不变”或“变小”）。
II.下图是制备抗埃博拉病毒（EBOV）VP40蛋白单克隆抗体的过程。请据图回答：
（1）利用PCR获取目的基因的过程中，反应体系内要加入含有VP40基因的DNA、dNTP、Taq酶和根据______________合成的引物，且反应需要在一定的_________溶液中才能进行。
（2）选用EcoRI和XhoI双酶切的优点是___________________________________________；VP40基因进入大肠杆菌细胞，并在大肠杆菌内维持稳定和表达，该过程可称为___________。
（3）过程⑥常用的不同于植物原生质体融合的促融方法是用____________处理。若把在HAT选择培养基上存活的细胞全部培养在同一培养基中，并从中提取出的抗体_______是或不是）单克隆抗体。图示过应用的生物技术是____________________________________。
抗旱植物体内的抗旱基因为R，旱敏基因为r。研究表明，多数抗旱性农作物能通过细胞代谢，产生一种代谢产物，调节根部细胞内的渗透压，此代谢产物在叶肉细胞内很难找到。
（1）抗旱性农作物的叶肉细胞内难以找到与抗旱有关的代谢产物的原因是 。
（2）现已制备足够多的R探针和r探针，通过探针来检测某植物相关的基因型。请据图分析回答：
①图中扩增基因常用的方法是 。若已提取到某抗旱植物Rr的叶肉细胞总DNA， （能或不能）以DNA为模板直接扩增抗旱基因，扩增过程中寻找抗旱基因的位置依靠 。
②图中处理基因获取单链DNA常用的方法有 。
③滤膜上DNA分子杂交发生在 两者之间。
④若被检植物只发生A现象，则被检植物的基因型为 。
小鼠是继果蝇之后的又一种模式动物，下图1表示生产长效胰岛素转基因小鼠培育过程示意图，图2表示图1中③表达载体构建过程图示。请回答下列问题：
（1）图1中的过程①注射A物质的目的是使供体母鼠__________________，若进行体外受精，则需将未成熟的卵子培养至_______________才具备受精能力。
（2）在图2中，当目的基因的DNA用HindⅢ、BamhⅠ完全酶切后反应管中有________种DNA片段，经过程⑧形成的重组质粒上将有______________限制酶的切点。
（3）为确保目的基因在小鼠细胞中进行表达，图2的⑧过程在构建基因的表达载体时，需将目的基因插在____________________两种片段之间，将表达载体送入细胞时，图1中的过程④常用的方法是_______________________________________。
（4）为检测目的基因是否成功表达，通常采用的方法是____________________。
利用相关工程技术可以获得抗黑腐病杂种黑芥-花椰菜植株，已知野生黑芥具有黑腐病的抗性基因，而花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病，技术人员用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力，再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，流程如下图。
据图回答下列问题：
（1）该过程用到的工程技术有 和 。
（2）过程①所需的酶是 ,过程②PEG的作用是 ，经过②操作后，需筛选出融合的杂种细胞，显微镜下观察融合的活细胞中有供体的叶绿体存在可作为初步筛选杂种细胞的标志。
（3）原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是 。原生质体经过细胞壁再生，进而分裂和脱分化形成 。
（4）若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和双亲植株的根尖，制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的 ；将杂种植株栽培在含有 的环境中，可筛选出具有高抗性的杂种植株。
绒山羊所产山羊绒因其优秀的品质被专家称作“纤维宝石”，是纺织工业最上乘的动物纤维纺织原料。毛角蛋白II型中间丝(KIF II)基因与绒山羊的羊绒质量密切相关。图甲表示含KIF II基因的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图乙是获得转KIF II基因的高绒质绒山羊的简单流程图(MspI、BamHI、MboI、SinaI四种限制性核酸内切酶识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG)。请分析回答：
(1)用SmaI完全切割图甲中DNA片段，其最短的产物含_______个bp。图甲中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从隐性纯合子中分离出图甲对应的DNA片段，用SmaI完全切割，产物中不同长度的DNA片段有_______种。
(2)上述工程中，KIF II称为_________；为了提高试验成功率，需要通过_______技术进行扩增，以获得更多的KIF II。
(3)过程①必须用到的工具酶是________；在过程③中，为了获得更多的卵(母)细胞，需用_________处理成年母绒山羊。
(4)过程④称为________，进行过程⑤的最佳时期是________。
应用生物工程技术可获得人们需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题：
⑴在培育转人生长激素基因牛过程中，人的基因能和异种生物（牛）的基因拼接在一起，是因为它们都具有双螺旋结构，都是由（填基本单位）构成的，遵循碱基互补配对原则；在拼接的操作过程中，所用的基因的“针线”是 。
⑵转人生长激素基因牛可通过分泌的乳汁来生产人生长激素，在基因表达载体中，人生长激素基因的首端必须含有（乳腺蛋白基因的） 。③过程培养到桑椹胚或囊胚阶段，可以采用 和胚胎移植技术，培育出多头相同的转基因犊牛。
⑶prG能激发细胞不断分裂，通过基因工程导入该调控基因来制备单克隆抗体，Ⅱ最可能是 细胞，Ⅲ代表的细胞具有 的特点。单克隆抗体最主要的优点是 ，并可能大量制备。
⑷在抗虫棉培育过程中，⑤过程采用的技术是 。
下表中列出了几种限制酶识别序列及其割位点，图一、图二中箭头表示相关限制酶的位点。请回答下列问题：
| 限制酶 |
BamH I |
Hind Ⅲ |
EcoR I |
Sma I |
| 识别序列及切割位点 |
↓ GGATCC CCTAGG ↑ |
↓ AAGCTT TTCGAA ↑ |
↓ GAATTC CTTAAG ↑ |
↓ CCCGGG GGGCCC ↑ |
（1） 一个图一所示的质粒分子经Sma I切割前后，分别含有___________个游离的磷酸基团。
（2） 若对图一中质粒进行改造，插入Sma I 酶切位点越多，质粒的稳定性越_____________。
（3） 用图中的质粒和外源ＤＮＡ构建重组质粒，不能使用Sma I切割，原因是____________。
（4） 与只是用EcoR I 相比较，使用BamH I和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止___________。
（5） 为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_______________。
（6） 重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_____________。
（7） 为了从cDNA 文库中分离获取蔗糖转基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖的能力的大肠杆菌突变体，然后在________________的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。
（8）若将某一目的基因转入某一植物的核基因组中，确定该目的基因是否已整合到某一染色体上，方法之一是测定该染色体的___________________。
下面是将乙肝病毒控制合成的病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。
资料1：巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生活的唯一碳源，同时AOX1基因（醇氧化酶基因）受到诱导而表达，5'AOX1和3'AOXl（TT）是基因AOX1的启动子和终止子，此启动子也能使外源基因高效表达。
资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，下图为科学家改造的pPIC9K质粒，其与目的基因形成的重组质粒在特定部位酶切后形成的重组DNA片段可以整合到酵母菌染色体上，最终实现目的基因的表达。
（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上_________限制酶识别序列（SnaB I、Avr II、SacI、Bgl II四种限制酶的识别序列均不相同），这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
（2）酶切获取HBsA9基因后，需用______________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，根据步骤②可知步骤①将重组质粒先导入大肠杆菌的目的是______________。
（3）步骤3中应选用限制酶______________来切割从大肠杆菌分离的重组质粒从而获得图中所示的重组DNA片段，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入______________以便筛选。
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入______________以维持其生活，同时诱导HBsA9基因表达。
（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行_______并分泌到细胞外，便于提取。
（7）培育转化酵母细胞所利用的遗传学原理是______________。
Ⅰ(10分)下面是从蛙体内剥离出的某反射弧结构的模式图，其中甲表示神经中枢，乙、丙未知。神经元A、B上的1、2、3、4为四个实验位点。现欲探究神经元A是传出神经元还是传入神经元，结合所给器材完成以下内容。
材料：从蛙体内剥离出的某反射弧(反射弧结构未被破坏)。供选择仪器：剪刀，电刺激仪，微电流计。
(1)如果该反射弧的效应器为传出神经末梢及其连接的肌肉。探究神经元A是传出神经元还是传入神经元的方法步骤(只在神经元A上完成)：
①先用剪刀在神经元A的______将其剪断；
②再用电刺激仪刺激神经元A上的实验位点______，若____________，则神经元A为传入神经元，反之则为传出神经元。
(2)如果在实验过程中要保证神经元A和神经元B的完整性，探究神经元A是传出神经元还是传入神经元的方法步骤(每个实验位点只能用一次)：
①将微电流计的两个电极分别搭在实验位点2和实验位点3的神经纤维膜外；
②用电刺激仪刺激实验位点________，若微电流计的指针偏转________次，则神经元A为传出神经元；若微电流计的指针偏转______次，则神经元A为传入神经元。该实验结果表明兴奋在神经元间传递的特点为______，具有这种特点的原因是______________。
Ⅱ.(9分)下图为科学家采用不同方法培育良种牛的过程，请据图回答有关问题：
（1）与一般的繁育良种动物方式相比较，胚胎移植的优势是____________。在获取卵母细胞之前需用促性腺激素对奶牛进行处理，目的是____________。
（2）“转基因牛”D培育过程中作为外源基因的受体细胞，主要原因是____________。
（3）图中数字标号③代表的结构为______，③将来发育为______，c→d过程需对其均等分割的目的是______和______。 A、B牛基因型是否相同？______。
（4）以上培育过程中，用到的生物技术名称是____________（至少答两个）。
回答下列有关基因工程的问题。
苏云金杆菌 （Bt）能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图 （
为抗氨苄青霉素基因），①~④表示过程。
（1）由HindⅢ酶切后，得到DNA片段的末端是 （）
（2）将图中①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ完全酶切后，产生 种DNA片段，②过程可获得 种重组质粒。如果只用BamHⅠ酶切，目的基因与质粒连接后可获得 种重组质粒。
（3）该过程中Bt毒素蛋白基因插入质粒后，不应影响质粒的 （） （多选）
| A．复制 | B．转录 | C．碱基对的数量 | D．抗性基因的表达 |
（4）此基因工程中大肠杆菌质粒的作用是 ，根瘤农杆菌的作用是 。生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的 基因的基因频率的增长速率。
普通棉花中含β-甘露糖苷酶基因（GhMnaA2），能在纤维细胞中特异性表达，产生的β-甘露糖苷酶催化半纤维素降解，棉纤维长度变短。为了培育新的棉花品种，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体，利用农杆菌转化法导入棉花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如下。请分析回答：
（1）①和②过程中所用的限制性内切酶分是 、 。
（2）基因表达载体除了图示组成外，至少有 等（至少答两个）。
（3）③过程中用酶切法可鉴定正、反义表达载体。用SmaⅠ酶和NotⅠ酶完全切割正义基因表达载体获得0．05kb、3．25kb、5．95kb、9．45kb四种长度的DNA片段，则用NotⅠ酶切反义基因表达载体获得DNA片段的长度应是 和 。
（4）④过程中利用农杆菌介导转化棉花细胞的过程中，整合到棉花细胞染色体DNA的区段是 ，转化后的细胞再通过 形成植物体。
（5）导入细胞内的反义GhMnaA2转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2转录的mRNA互补配对，从而 （促进或抑制）基因的表达，其意义是 。
埃博拉病毒（EBO）中EBOV是一种烈性的、泛嗜性的病毒，它首先破坏吞噬细胞，其次是肝、脾等细胞，进而导致血管通透性增加，出现严重的出血热现象。目前尚无针对该病毒的特效药或疫苗。
（1）EBOV感染者的血清中很难形成高浓度的抗体，这是因为 。
（2）较难制作EBO疫苗的原因与其遗传物质的种类以及表达方式有关。EBO病毒容易变异，这是因为 。
（3）下图示利用“细胞技术”研制抗击EBO的药物与疫苗：过程①获得的甲细胞是 细胞；图中所用瘤细胞的作用是 。要获得纯净的单一品种抗体，上述操作的要点是 。
（4）还可以利用转基因技术生产EBO蛋白疫苗。EBO结构和基因组如下图所示。EBO衣壳外的包膜上有5种蛋白棘突（包括GP蛋白和VP系列蛋白），其中GP蛋白最为关键，能被宿主细胞强烈识别。该技术的目的基因是 。
（5）腺病毒（基因E与复制、转录有关；基因L是腺病毒衣壳基因）具有弱致病性，但病毒在人体细胞内增殖会导致正常细胞裂解、死亡。因此，需要对腺病毒进行改造。下图示腺病毒基因组、转基因技术生产EBO蛋白疫苗与重组病毒粒子疫苗的基本过程。
以EBO病毒包膜蛋白作为疫苗比较安全的原因是 。生产含目的基因重组病毒粒子作为目的基因的运载体，优点是 ；为保障安全，基因重组病毒粒子需要除去自身原本的一些基因，改用辅助质粒携带这些基因。则除去的基因主要是 两类基因。
（6）辅助质粒携带EBO病毒上的这些基因，与EBO携带一样，均能在真核细胞中表达，说明 。
内皮素（ET）是一种多肽,主要通过与靶细胞膜上的ET受体（ETA）结合而发挥生物学效应。科研人员通过构建表达载体，实现ETA基因在大肠杆菌细胞中的高效表达，其过程如下图所示，
图中SNAP基因是一种荧光蛋白基因，限制酶ApaⅠ的识别序列为
，限制酶XhoⅠ的识别序列为
。请据图分析回答：
（1）进行过程①时，需要加入缓冲液、引物、dNTP和___________酶等。完成过程①②③的目的是
___________。
（2）过程③和⑤中，限制酶XhoⅠ切割DNA，使___________键断开，形成的黏性末端是___________。
（3）构建的重组表达载体，目的基因上游的启动子是___________的部位，进而可驱动基因的转录。除图中已标出的结构外，基因表达载体还应具有的结构是___________。
（4）过程⑥要用CaCl2预先处理大肠杆菌，使其成为容易吸收外界DNA的___________细胞。
（5）将SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，其目的是有利于检测___________。
材料Ⅰ：家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。材料Ⅱ：毛角蛋白Ⅱ型中间丝（KIFⅡ）基因与绒山羊的羊绒质量密切相关。获得转KIFⅡ基因的高绒质绒山羊的简单流程如图。
请依材料所给出的信息分析回答下列问题：
（1）在基因工程操作程序中，是基因工程的核心，为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的和之间。
（2）采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应包含：扩增缓冲液（含Mg2＋）、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、和。
（3）据材料Ⅱ，在过程②中，将成纤维细胞置于5％CO2的气体环境中，CO2的作用是。在过程③中，用处理以获取更多的卵（母）细胞。成熟卵（母）细胞在核移植前需要进行处理。
（4）从重组细胞到早期胚胎过程中所用的胚胎工程技术是。在胚胎移植前，通过技术可获得较多胚胎。
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