回答下列有关基因工程的问题。
苏云金杆菌 （Bt）能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图 （
为抗氨苄青霉素基因），①~④表示过程。
（1）由HindⅢ酶切后，得到DNA片段的末端是 （ ）
（2）将图中①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ完全酶切后，产生 种DNA片段，②过程可获得 种重组质粒。如果只用BamHⅠ酶切，目的基因与质粒连接后可获得 种重组质粒。
（3）该过程中Bt毒素蛋白基因插入质粒后，不应影响质粒的 （ ） （多选）
| A．复制 | B．转录 | C．碱基对的数量 | D．抗性基因的表达 |
（4）此基因工程中大肠杆菌质粒的作用是 ，根瘤农杆菌的作用是 。生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的 基因的基因频率的增长速率。
GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：
（1）构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的 限制酶进行酶切。
（2）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有3种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaⅠ酶和BamHⅠ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第
泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。
（3）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的 与提取的蛋白质杂交。当细胞培养的神经干细胞达到一定密度时产生接触抑制，换瓶后进行 培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
（4）对于神经干细胞可以来源于胚胎干细胞的诱导分化，胚胎干细胞来源于 ，在培养时可以只分裂不分化，但是通过诱导可以分化成各种不同的组织细胞，胚胎干细胞的这个特性称为 。
（5）胚胎干细胞也可以来自于核移植的重组细胞，一般体细胞核移植要比胚胎细胞核移植难度大，原因是 ，而取自卵巢的卵母细胞需要培养到 期，才可进行核移植。
普通棉花中含β-甘露糖苷酶基因（GhMnaA2），能在纤维细胞中特异性表达，产生的β-甘露糖苷酶催化半纤维素降解，棉纤维长度变短。为了培育新的棉花品种，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体，利用农杆菌转化法导入棉花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如下。请分析回答：
（1）①和②过程中所用的限制性内切酶分是 、 。
（2）基因表达载体除了图示组成外，至少有 等（至少答两个）。
（3）③过程中用酶切法可鉴定正、反义表达载体。用SmaⅠ酶和NotⅠ酶完全切割正义基因表达载体获得0．05kb、3．25kb、5．95kb、9．45kb四种长度的DNA片段，则用NotⅠ酶切反义基因表达载体获得DNA片段的长度应是 和 。
（4）④过程中利用农杆菌介导转化棉花细胞的过程中，整合到棉花细胞染色体DNA的区段是 ，转化后的细胞再通过 形成植物体。
（5）导入细胞内的反义GhMnaA2转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2转录的mRNA互补配对，从而 （促进或抑制）基因的表达，其意义是 。
下图表示转基因动、植物的成功培育过程，有关叙述错误的是（ ）
A．目的基因导入受体细胞A前,受体细胞要用Ca2+处理,使其处于感受态
B．①过程用到的生物技术包括动物细胞培养、胚胎移植
C．过程②要用到植物组织培养技术
D．可通过标记基因对受体细胞A、B进行筛选
转基因生物可用于生产人类所需要的药用蛋白，如激素、抗体、疫苗、酶等。下图甲是通过生物工程培育能产生人胰岛素的烟草的过程。请据图回答下列问题：
（1）基因工程的核心步骤是________（填字母）。此过程所需的工具酶是______________。
（2）下图乙是载体和反转录得到的胰岛素基因的片段，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。Gene Ⅰ和Gene Ⅱ为质粒上的标记基因，根据图示分析，应用限制酶________切割质粒，用限制酶________切割目的基因。构建的重组质粒中，除含有外源基因、标记基因外，还必须含有________和________。
（3）B过程中，常用________处理使细菌成为感受态细胞，从而利于重组质粒的导入。
（4）如果从分子水平检测人胰岛素基因是否表达成功，可以采用______________方法。
烟草花叶病毒（TMV）是一种在烟草及蔬菜等经济作物中广泛传播的病毒，对农业生产造成很大的危害。研究者利用植物基因工程的方法将烟草花叶病毒外壳蛋白基因（CP基因）导入烟草并在转化的烟草植株中表达，使其获得对烟草花叶病毒的抗性。下图是转化烟草植株的培育流程，请回答：
（1）含有CP基因的cDNA文库是通过将TMV的RNA进行 获得的。在对cDNA进行PCR扩增时，设计的引物自身不能含有 序列。
（2）将CP基因导入土壤农杆菌质粒的 ，其原因是 。
（3）含重组质粒的土壤农杆菌与烟草叶共培养前，对烟草叶的处理要求是 。
（4）共培养形成愈伤组织时的培养条件是必须 （有光或避光）。
（5）在配置诱导芽、根的培养基时，要注意在不同的培养阶段需调整 的比例。最终检测转基因是否成功，可用 方法进行检测。
利用相关工程技术可以获得抗黑腐病杂种黑芥-花椰菜植株，已知野生黑芥具有黑腐病的抗性基因，而花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病，技术人员用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力，再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，流程如下图。
据图回答下列问题：
（1）该过程用到的工程技术有 和 。
（2）过程①所需的酶是 ,过程②PEG的作用是 ，经过②操作后，需筛选出融合的杂种细胞，显微镜下观察融合的活细胞中有供体的叶绿体存在可作为初步筛选杂种细胞的标志。
（3）原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是 。原生质体经过细胞壁再生，进而分裂和脱分化形成 。
（4）若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和双亲植株的根尖，制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的 ；将杂种植株栽培在含有 的环境中，可筛选出具有高抗性的杂种植株。
埃博拉病毒（EBO）中EBOV是一种烈性的、泛嗜性的病毒，它首先破坏吞噬细胞，其次是肝、脾等细胞，进而导致血管通透性增加，出现严重的出血热现象。目前尚无针对该病毒的特效药或疫苗。
（1）EBOV感染者的血清中很难形成高浓度的抗体，这是因为 。
（2）较难制作EBO疫苗的原因与其遗传物质的种类以及表达方式有关。EBO病毒容易变异，这是因为 。
（3）下图示利用“细胞技术”研制抗击EBO的药物与疫苗：过程①获得的甲细胞是 细胞；图中所用瘤细胞的作用是 。要获得纯净的单一品种抗体，上述操作的要点是 。
（4）还可以利用转基因技术生产EBO蛋白疫苗。EBO结构和基因组如下图所示。EBO衣壳外的包膜上有5种蛋白棘突（包括GP蛋白和VP系列蛋白），其中GP蛋白最为关键，能被宿主细胞强烈识别。该技术的目的基因是 。
（5）腺病毒（基因E与复制、转录有关；基因L是腺病毒衣壳基因）具有弱致病性，但病毒在人体细胞内增殖会导致正常细胞裂解、死亡。因此，需要对腺病毒进行改造。下图示腺病毒基因组、转基因技术生产EBO蛋白疫苗与重组病毒粒子疫苗的基本过程。
以EBO病毒包膜蛋白作为疫苗比较安全的原因是 。生产含目的基因重组病毒粒子作为目的基因的运载体，优点是 ；为保障安全，基因重组病毒粒子需要除去自身原本的一些基因，改用辅助质粒携带这些基因。则除去的基因主要是 两类基因。
（6）辅助质粒携带EBO病毒上的这些基因，与EBO携带一样，均能在真核细胞中表达，说明 。
图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp Ⅰ、BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、Sma Ⅰ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：
（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 （基团）连接。
（2）若用限制酶Sma Ⅰ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是 末端，其产物长度为 。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma Ⅰ完全切割，产物中共有 种不同DNA片段。
（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加 的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是 。
（5）有关质粒描述错误的是（ ）
A、质粒是能够自我复制的环状DNA分子
B、质粒是唯一的运载体
C、质粒上有多个酶切位点
D、质粒可在宿主外单独复制
[生物－选修3：现代生物科技专题]下列是生物学技术制备抗体的两个途径模式简图。
（1）在获取抗体之前，需要向健康人体注射特定抗原（如乙肝疫苗），并且每隔一周重复注射一次。免疫学细胞A在人体主要介导（参与）_____________免疫。
（2）过程①和②得到的Y细胞称为_____________。得到的单克隆抗体最主要的优点是__________。
（3）④过程需要______________酶，⑤过程则需要特定的限制性核酸内切酶和DNA连接酶。
（4）抗体1与抗体2的氨基酸排列顺序相同，两者的空间结构是否相同？__________
为什么？__________
（5）如果想用棉花产生该种抗体，则⑥过程的受体细胞通常选用___________，经过筛选后再侵染棉花体细胞，转化成功后通过__________技术获得能产抗体的转基因棉花植株。
苏云金芽抱杆菌能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。如图是培育转毒素蛋白基因植物及转基因植物中两种生物大分子合成的部分过程示意图。请据图回答问题:
（1）将图中①处的DNA用HindⅢ、BamH I完全酶切后，反应管中有 种DNA片段。过程②需要用到 酶。
（2）假设图中质粒原来BamH I的识别序列变为Bcl I的识别序列，现用Bcl I和HindⅢ切割质粒，再经过程②能否获得所需重组质粒? ，理由是 。
（3）若上述假设成立，并成功形成重组质粒，则重组质粒可被限制酶 切割。
（4）图中α链是 。不同组织细胞的相同DNA进行过程③时启用的起始点 （填“都相同”“都不同”或“不完全相同”），原因是 。
PCR是聚合酶链式反应的缩写，利用PCR技术可对目的基因进行扩增。请根据下面PCR反应原理示意图回答有关问题:
（1）PCR的原理是 。
（2）PCR技术使DNA解链是通过 实现的，DNA的这种解链现象在一定的条件下是 （填“可逆的”或“不可逆的”）。
（3）DNA解链后冷却的目的是让 与 相结合。
（4）当温度加热至70～75℃时，是 酶把单个脱氧核背酸，通过 键连接到引物上。如此逐渐延伸形成互补链，进而使目的基因加倍。
（5）通过重复循环（3）、（4）、（5）过程，使目的基因以 形式扩增。
在荧光素酶中加入正确的荧光素底物就可以发荧光。荧光素酶及其合成基因在生物研究巾有着广泛的应用。请回答下列问题：
（1）荧光素酶基因可以人工合成，也可以从 中获取。利用PCR技术扩增荧光素酶基因是利用___ _的原理。
（2）限制酶是切割DNA的工具酶，主要从 中分离纯化出来。下表为4种限制酶的识别序列和酶切
位点，下图为含有荧光素酶基因的DNA片段及其具有的限制酶切点。若需利用酶切法（只用一种酶）获得荧光素酶基因，最应选择的限制酶是
（3）荧光素酶基因常被作为基因工程中的标记基因，其作用是将 筛选出来。荧光素酶基因也可以作为目的基因转入某些动植物细胞中表达产生荧光素酶。将目的基因导入动物细胞的技术中，应用最多的是____。
（4）将目的基因导入植物细胞，目前常用的目的基因载体是Ti质粒，目的基因需插入到该基因载体的 上。将导人荧光素酶基因的植物细胞，可经过 技术获得转基因植株。
随着科学技术的发展，人们可以根据人类的需求来改造生物的性状，在许多领域取得了可喜的成果，图中是利用奶牛乳汁生产血清白蛋白的图解，根据下图回答：
（1）在此过程中涉及的动物细胞工程技术有 、_________________。
（2）在基因工程中，我们称②为____ 。为了使血清白蛋白基因在羊恰当的细胞中表达，基因表达载体中除②片段外，还应该有牛的乳腺蛋白的 ，其是__________识别和结合的位点。
（3）图中①一般经____ ___处理可以得到③，从③到④的过程中一般用未受精的 细胞去核后作为受体，不用普通的体细胞。
（4）要实现⑦批量生产血清白蛋白，则要求③的性染色体是 。
下面是将乙肝病毒控制合成的病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。
资料1：巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生活的唯一碳源，同时AOX1基因（醇氧化酶基因）受到诱导而表达，5'AOX1和3'AOXl（TT）是基因AOX1的启动子和终止子，此启动子也能使外源基因高效表达。
资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，下图为科学家改造的pPIC9K质粒，其与目的基因形成的重组质粒在特定部位酶切后形成的重组DNA片段可以整合到酵母菌染色体上，最终实现目的基因的表达。
（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上_________限制酶识别序列（SnaB I、Avr II、SacI、Bgl II四种限制酶的识别序列均不相同），这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
（2）酶切获取HBsA9基因后，需用______________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，根据步骤②可知步骤①将重组质粒先导入大肠杆菌的目的是______________。
（3）步骤3中应选用限制酶______________来切割从大肠杆菌分离的重组质粒从而获得图中所示的重组DNA片段，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入______________以便筛选。
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入______________以维持其生活，同时诱导HBsA9基因表达。
（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行_______并分泌到细胞外，便于提取。
（7）培育转化酵母细胞所利用的遗传学原理是______________。
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