广西省水牛研究所科研人员利用克隆胚胎冷冻技术，使一头杂交母水牛顺利产下一头冷冻胚胎移植的体细胞克隆雌性水牛犊，取名“盼盼”。它的出生经历了一个严密复杂的科学操作过程（如图所示）：
⑴当克隆牛“盼盼”性成熟后进行减数分裂，其初级卵母细胞内可以形成 个四分体。
⑵①、④过程主要采取 技术才能获得细胞群或囊胚，此时在培养液中常加入一定量的二氧化碳，其目的是 。③过程中常用方法是 。
⑶根据项目专家介绍，水牛克隆胚胎冷冻技术的研究成功，有利于水牛克隆技术的推广应用，其重要意义在于 （答出一点即可）。
已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。人淋巴细胞中有DNA合成的S途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖。将这两种细胞在试管中混合，加入聚乙二醇促进融合，获得杂种细胞（一般只考虑细胞两两融合）。
请回答：
（1）试管中细胞的种类数和能增殖的细胞种类数分别是 。
（2）设计方法是（不考虑机械方法）从培养液中分离出杂种细胞，分析回答：
方法：在培养液中添加入 再收集增殖的细胞。
原理：加入该物质后，使 合成途径阻断，仅有该合成途径的 细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞可以利用淋巴细胞中的 途径合成DNA而增殖
下图为细胞融合的简略过程，请据图回答：
（1）若A、B是植物细胞，在细胞融合之前须处理获得原生质体，由A、B到细胞C的过程中，常用的促融剂是__________________。融合完成的标志是_____________。
（2）若A、B是植物细胞，则形成的D细胞还要应用____________技术把D培养成植株。
（3）在组织培养培养过程中，除了提供水分和必要的有机营养物质外，还需要在培养基中加入___ __和___ _。同时，培养过程中，除保证必要的温度、光照和氧气等外界条件外，还必须保证的关键条件是_____ _ _________。
为了验证促进有丝分裂的物质对细胞分裂的促进作用。将小鼠的肝细胞悬浮液分成等细胞数目的甲、乙两组，在甲组的培养液中加入3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸（3H—TdR）；乙组中加入等剂量的3H—TdR并加入促进有丝分裂的物质。培养一段时间后，分别测定甲、乙两组细胞的总放射性强度。据此回答下列问题：
⑴细胞内3H—TdR参与合成的生物大分子是 ，该种分子所在细胞结构名称 、 。
⑵乙组细胞的总放射性强度比甲组的 ，原因是 。
⑶细胞利用3H—TdR合成生物大分子的过程发生在细胞周期的 期。在上述实验中选用3H—TdR的原因是 。
(4)培养肝细胞的培养液与培养植物细胞的培养基的主要不同点是前者含有 等。将小鼠的肝细胞制成悬浮液的方法是用 处理肝组织，使其分散成单个细胞，再加入培养液。培养肝细胞的培养箱中加入较多的二氧化碳，其作用是 。
生物学家研究发现，癌细胞的无限增殖受某调控基因的控制，该调控基因能激发所有动物细胞大量增殖，为探究该调控基因是存在于细胞质还是细胞核上，科研人员做了如下实验设计：
根据以上思路，请继续完成下列实验设计方案：
Ⅰ．实验方案：（实验提示：癌细胞能传代培养，细胞形态发生明显改变。如何观察细胞形态不作实验设计要求。）
①用胰蛋白酶分别处理宫颈癌细胞和小鼠肝脏使之分散成单个细胞。
②分别使单个癌细胞和单个肝脏细胞核质分离。
③
④取2只培养编号甲、乙，各加入等量的培养液。
⑤
⑥
Ⅱ．预期实验结果及结论：
①
②
③
（每空1分，8分）下面两幅图分别是单克隆抗体制备过程和克隆羊培育过程示意图，请据图回答下列问题：
(1)图甲和图乙所示的过程中，都必须用到的动物细胞工程技术手段是 。
(2)图甲中②过程常在 诱导下完成。
(3)单克隆抗体能定向攻击癌细胞，主要是利用其 。
(4)若不考虑环境因素影响，克隆羊的性状全部像白面绵羊吗？ 。
原因是 。
(5)图乙过程的技术具有多种用途，但是不能（ ）
A.有选择地繁殖某一性别的家畜 B.繁殖家畜中的优良个体
C.用于保存物种 D.改变动物的核基因
(6)在现有技术条件下，还不能将从动物体内分离出来的成熟的体细胞直接培养成一个新个体，而是必须将体细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中才能发育成新个体，你认为原因最可能是 。
A.卵细胞大，便于操作
B.卵细胞含有的营养物质多
C.卵细胞的细胞质可使体细胞核全能性得到表达
D.重组细胞才具有全能性
“白菜—甘蓝”是科学家用细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种，它具有生长期短、耐热性强和易储存等优点。如图是“白菜—甘蓝”培育过程示意图，请完成下列问题：
(1)由杂种细胞D培育成白菜—甘蓝植株，采用的技术手段是_____________。该过程说明植物细胞具有____________。
(2)要制备“白菜—甘蓝”的人工种子，要在d步骤选取具有生根、发芽能力的__________结构，包裹上人工种皮即可。
(3)在d过程培养中，培养基的成分通常包括水、无机盐、有机营养和_______________等，同时在培养过程中，除必要的温度、光照和氧气等外界条件外，成功的另一个关键是操作过程中必须保证__________________。
(4)在a过程中诱导原生质体融合最常用的诱导剂是______________，融合依据的原理是______________________________。
(5)要获得图中白菜和甘蓝的原生质体，首先需要用____________________分别除去白菜和甘蓝细胞的细胞壁。
(7分)现有甲、乙两种可能有一定致畸、致癌作用的化学物质，利用动物细胞培养的方法能够鉴定它们是否有毒性，并比较二者毒性的强弱。请完成下列实验报告：
Ⅰ.实验材料：小白鼠胚胎。
Ⅱ.药品用具：胰蛋白酶液、动物细胞培养液、动物细胞固定液、适宜浓度的龙胆紫溶液、滴管、培养皿、剪刀、锥形瓶、细胞培养箱、载玻片、盖玻片、光学显微镜、小白鼠正常体细胞有丝分裂高倍显微镜照片。
Ⅲ.实验原理： 。
根据这些变异细胞占全部培养细胞的百分数(以下称Q值)，可判断该化学物质的毒性。
Ⅳ.实验步骤：
(1)制备细胞悬浮液：
把小白鼠胚胎进行处理离散成单个细胞后，加入动物细胞培养液，制成细胞悬浮液。
（2）进行细胞培养：
①取A、B、C三个洁净的培养瓶，分别加入等量的细胞悬浮液。
② 。
③C瓶不作处理，作为对照。
把三个培养瓶放在37℃(或适宜温度)的细胞培养箱中培养
（3）制作临时装片：
①当细胞繁殖到大约第8代左右时，同时取出三个培养瓶，用胰蛋白酶液处理，使细胞从瓶壁上脱落，加入动物细胞固定液杀死细胞并固定其分裂相。
②静置一段时间后，分别从各培养瓶底部吸取适量的悬浮液。滴在与培养瓶有相同编号的载玻片的中央，加1～2滴适宜浓度的 染色，3～5min后，盖上盖玻片，制成临时装片。
（4）镜检和统计：把临时装片放在显微镜下，按照 的顺序观察，寻找处于有丝分裂 期的细胞，观察其染色体，并与小白鼠正常体细胞有丝分裂高倍显微镜照片对比以确认发生上述变异的细胞，同时统计该期变异的细胞占该细胞总数的百分数(Q值)。
V.实验结果：
| 培养瓶 |
A |
B |
C |
| Q值 |
1.3％ |
12.5％ |
0.1％ |
VI.实验结论： 。
(8分)右图为动物细胞培养过程中细胞增殖情况的变化曲线(图中B、E两点表示经筛选、分装后继续培养)，请据图回答下列问题：
(1)OB段的培养称为 培养，AB段可能发生了 现象，使增殖速率减缓，用 酶可使组织细胞分散开来，分装到多个卡氏瓶中进行 培养。
(2)B点的细胞群体称为 。B点时筛选出一个细胞，通过 方法单独培养使之繁衍成一个新的细胞群体，该细胞群体称为 。
(3)E点后的细胞大多数具有 核型，从而可连续传代。
某研究小组欲将已知抗盐基因导人原生质体培育抗盐菊科植物。请回答：
（1）为获得大量抗盐基因，可通过 技术进行扩增，也可将其连接到 上，通过大肠杆菌培养扩增。
（2）制备叶片原生质体的酶混合液中，一般含较高浓度的甘露醇，其目的是避免制备的原生质体 。酶混合液需通过 灭菌，才能用于无菌原生质体的制备，整个无菌操作过程需在 中进行。
（3）可通过 方法，直接将抗盐基因导入原生质体的细胞核。此外，还可用聚乙二醇融合、电击等方法导入。导入后的原生质体需再生出 ，经持续分裂获得愈伤组织，进一步分化获得再生植株并扩大繁殖。
（4）利用带有标记的抗盐基因特殊片段与从转基因植株提取的RNA进行 ，验证抗盐基因是否被整合到受体的细胞中并转录。通过将扩大繁殖的再生植株转接到含有 的培养基，根据生长状况初步筛选出抗盐植株。
（5）为了获得大量该转基因植株，可将带腋芽的茎段转入适宜培养基中，获得大量 ，然后转入生根培养基中诱导生根，形成再生植株。再生植株需进行 （不定项选择：
| A．无菌处理 |
| B．锻炼 |
| C．去除根部残留的培养基 |
| D．逐步提高湿度处理）后才能移种大田。 |
回答下列有关动物细胞培养的问题：
(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂长到细胞表面 时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的 。此时，瓶壁上形成的细胞层数是 。要使贴壁细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是 。
(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现 的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成 细胞，该种细胞的黏着性 ，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量 。
(3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是 。
(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到 期的细胞用显微镜进行观察。
(5)在细胞培养过程中，通常在 条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中 的活性降低，细胞 的速率降低。
(6)给患者移植经异体细胞培养形成的皮肤组织后，发生了 现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作 进行攻击。
回答下列有关动物细胞培养的问题：
(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂长年到细胞表面 时，细胞会停止分裂增增殖，这种现象称为细胞的 。此时，瓶壁上形成的细胞层数是 。要使贴壁细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是 。
(2)随首细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现衰老甚至死亡的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变面变成 细胞，该种细胞的黏着性 ，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量 。
(3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被污色，而活细胞不染色，原因是 。
(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到 期的细胞用显微镜进行观察。
(5)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作
进行攻击。
如下图所示，请据图回答下面的问题。
(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合”在一起，说明细胞膜_______________________________________。此过程，常用________作为诱导剂，该细胞的特点是_________________。
(2)已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖，鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请设计一种方法(不考虑机械方法)，从培养液中分离出杂交瘤细胞。
方法：____________________________________________。
(3)杂交瘤细胞繁殖进行的是___________分裂，其遗传性状________。
(4)杂交瘤细胞的体外培养与植物组织培养的培养基相比有何主要不同？
_____________________________________________________________。
(5)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等)并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹”，这是利用了____________________________________________________________。
2011年12月19日，在“中国（无锡）动物生物反应器产业高峰论坛”上，中国工程院院士李宁介绍：把牛奶变成母乳，这绝对是可能的。而把牛奶变成“人奶”的技术，就称之为“动物生物反应器”。动物生物反应器是以基因工程技术为核心，以动物体为“车间”，低成本大规模生产高附加值重组药物蛋白的新一代生物制药技术。下图是培育表达人类白细胞介素的牛乳腺生物反应器的技术路线。据图回答下列问题：
（1）基因工程的核心步骤是 。图中基因表达载体的组成，除具有复制原点、人类白细胞介素基因外，还必须具有启动子、 等。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，是 识别和结合的部位。
（2）过程①可采用的操作方法是 ，过程③采用的生物技术是 。在②过程的生物技术中，需对供体牛和受体牛进行 处理，为供体的胚胎移入受体提供相同的生理环境。
（3）为检测人类白细胞介素基因是否成功表达，可采用 技术。
（4）继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。该系统与乳腺生物反应器相比，具有哪些优点？（答出一点即可）
（5）为使外源基因在后代中长期保持，可将转基因动物体细胞的细胞核转入 中构成重组细胞，然后再运用一定的生物技术手段使其发育成与供体具有相同性状的个体。
在植物组织 培养过程中 ,激素的添加已成为一种常规的实验手段 ,在植物组织培养过程中已研究过的植物激素有 :生长素、细胞分裂素、赤霉素等。下表为某同学为研究激素的使用顺序对实验结果的影响，请回答相关问题：
| 使用顺序 |
实验结果 |
| 先使用NAA, 后使用KT |
有利于细胞分裂，但细胞不分化 |
| 先使用KT, 后使用NAA |
A |
| 同时使用 |
B |
（1）植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、 和 的关键性激素。该实验中属于细胞分裂素的是 。
（2）请将表格中空白处A和B补充完整，A为 ，B为 。
若NAA和KT的用量比值适中时，促进 的生长。
（3）用于离体培养的植物器官或组织称为 。若该实验材料为菊花，则应对其进行 （消毒/灭菌）。
（4）接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养环境应注意调节合适的 和 。接种过程中要注意在 旁进行。
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