粮食问题一直困扰着人类。为扩大可耕地面积，增加粮食产量，沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系。请据图回答下列问题：

图1 转基因操作流程图

表2 几种限制酶识别序列及切割位点表
（1）如果要将耐盐碱基因和质粒重组，必须对基因进行修饰和改造：在基因两侧的A和B位置分别加入____________限制酶识别序列，这样才有利于目的基因和质粒定向连接。
（2）过程②采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系需加入引物Ⅰ和引物Ⅱ等物质，若共用了引物Ⅱ31个，则目的基因扩增了_______代。
（3）若用EcoRⅠ和PstⅠ两种限制酶同时切割载体质粒，则能形成_______种不同长度的DNA片段，共有________个游离的磷酸基团。
（4)图示中将基因表达载体构建完成后没有直接导入农杆菌，而是先将其导入大肠杆菌，目的是____________________。
（5）在步骤⑤⑥过程中都需用________________处理两类细菌。为了确认目的基因通过⑦过程导入植物细胞中后是否成功表达，通常从分子水平进行检测的方法是用___________法。