重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。右图是利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。其主要没计思路是用具有互补配对片段的引物(图中引物2、引物3),分别PCR,获得有重叠链的两种 DNA片段,再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得目的基因。结合所学知识,分析下列问题。
(1)引物中G+C的含量影响着引物与模板DNA结合的稳定性,引物中G+C的含量越高,结合稳定性 。
(2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA 的过程中,必须将引物l、2和引物3、4 置于不同反应系统中,这是因为 。
(3)引物l、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制,共产生 种双链DNA分子。
(4)在引物1、引物2组成的反应系统中,经第一阶段形成图示双链DNA至少要经过 次复制。
(5)若利用微生物扩增该目的基因,其基本步骤包括: 、 、微生物的筛选和培养、从菌群中获取目的基因。