生物柴油是一种可再生清洁能源，其应用在一定程度上能够缓人类对化石燃料的消耗。科学家发现，在微生物M产生的脂肪酶作用下，植物油与甲醇反应能够合成生物柴油（如下图）。

⑴用于生产生物柴油的植物油不易挥发，宜选用           、           方法从油料作物中提取。
⑵筛选产脂肪酶的微生物M时，选择培养基中添加的植物油为微生物生长提供             ，培养基灭菌采用的最适方法是           
⑶测定培养液中微生物数量，可选用          法直接计数；从微生物M分离提取的脂肪酶通常需要检测             ，以确定其应用价值；为降低生产成本，可利用           技术使脂肪酶能够重复使用。
⑷若需克隆脂肪酶基因，可应用耐热DNA聚合酶催化的          技术。